Ūminės kvėpavimo takų infekcijos yra dažnos vaikų kvėpavimo takų ligos, kurias dažnai sukelia virusai. Kvėpavimo takų sincitinis virusas (RSV) ir kvėpavimo takų adenovirusas (ADV) yra du dažni patogenai, sukeliantys ūmias vaikų kvėpavimo takų infekcijas. Švelnūs atvejai gali sukelti peršalimo simptomus, tokius kaip kosulys ir sloga, o sunkūs atvejai gali sukelti sunkias komplikacijas, tokias kaip pneumonija ir vidurinės ausies vidurinė terpė. Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos rekomendacijomis, patogenų aptikimas turi būti greitas, tikslus, jautrus ir specifinis ir neturėtų remtis specializuotais technikais ar didelėmis instrumentais. Todėl ypač svarbu sukurti RSV ir ADV aptikimo metodą, kuris gali atitikti aukščiau pateiktus aptikimo reikalavimus.
Šenzheno vaikų ligoninės Pediatrijos instituto Ma Dongli režisieriaus grupė paskelbė straipsnį „Multiplex rekombinazės polimerazės amplifikacijos tyrimas, derinamas su CRISPR/ CAS12A, kad būtų galima aptikti kvėpavimo takų sincitalinį virusą ir kvėpavimo takų adenovirusą“, kurio poveikio koeficientas yra 4,6.
Tyrimų apžvalga
Daugiapakopė izoterminė greito branduolio rūgšties amplifikacijos technologija „MirA“ derinama su CRISPR/CAS aptikimo sistema. Projektuodami „Mira“ pradmenis ir CRISPR RNR (CRRNR), atlikdami kelis sekų palyginimus, optimizuojant reakcijos sąlygas ir naudojant fluorescencinius skaitmeninius aptikimo įtaisus, kad būtų galima patikrinti jautrumą ir specifiškumą.
Naudojant qPCR rezultatus kaip palyginimo kontrolę, buvo ištirtas 160 klinikinio gerklės tamponų mėginių bandymo rezultatų nuoseklumas.
Eksperimentiniai rezultatai
1. „Mira-Crispr/Cas12a“ aptikimo metodo jautrumas ir specifiškumas
Nustatant MIRA metodą, RSV-F1/R1 pradmenų pora naudojama branduolių rūgščių amplifikavimui iš gerklės tamponų, RSV, ADV, PIV, RHV, MP, CP, FLUB, HMPV, FLUA arba RSV/ADV bendrai užkrėstų pacientų. Išskyrus RSV ir ADV, kurie buvo amplifikuotos juostos, kiti rezultatai buvo neigiami, tai rodo, kad atrinkti MIRA pradmenys nebuvo kryžmiškai reaguoti su kitais aštuoniais tirtais patogenais ir buvo gerai išsaugoti.
Vėliau RSV ir ADV rekombinantinės plazmidės buvo praskiedžiamos 10 kartų, naudojant sterilų vandenį, o RSV ir ADV aptikimo ribos buvo 106Kopijos/ml.
(1-10: Gerklės tamponų mėginiai iš pacientų, sergančių RSV, RSV/ADV ko-infekcija ir kiti kvėpavimo takų patogeno mėginiai)
2. Palyginkite su qPCR
Palyginti su qPCR metodu, RSV ir ADV aptikimo ribos yra 103 kopijos/ml
(RSV ir Adv qPCR nustatymo jautrumas)
„Mira-CrisPR“ metodas yra labiau tinkamas visuomenės laboratorijoms, kurių aptikimo laikas yra trumpas, paprastas eksploatavimas ir nereikia didelio masto „QPCR“ instrumentų atlikti eksperimentines operacijas.
3. Klinikinių mėginių palyginimas
Gerklės tamponų mėginiai buvo paimti iš 160 vaikų, sergančių ūmine kvėpavimo takų infekcija. Tuo pačiu metu aptikimui buvo naudojamas „Mira-CrisPR“ ir qPCR metodas, o rezultatai buvo palyginti su klinikinių tyrimų rezultatais.
Palyginti su qPCR metodu, RSV ir ADV MIRA-CRISPR metodo jautrumas buvo atitinkamai 98,1% ir 91,4%, o aptikimo specifiškumas buvo 1 0 0%. „Kappa“ vertė yra didesnė nei 0,95, tai rodo aukštą nuoseklumo laipsnį.
MIRA-CRISPR metodas turi greito, jautraus ir specifinio RSV ir Adv aptikimo pranašumus. Tai gali greitai ir tiksliai aptikti virusines infekcijas ir yra labiau tinkama naudoti tose vietose, kuriose yra ribotų medicininių išteklių.