Straipsnyje siūloma nauja mikrofluidinės lustų technologija, skirta krevečių patogeninių mikroorganizmų multipleksinėms aptikti. Tyrimo komanda integruota daugiafunkcinio izoterminio greito nukleorūgščių amplifikacijos (MIRA) technologijos ir realaus laiko fluorescencijos aptikimo metodų. Šis mikrofluidinis lustas pateikia greitą, jautrų ir efektyvų sprendimą pagrindinių krevečių patogenų aptikimui vietoje.
Tyrimo pagrindas ir reikšmė
Pasaulinė krevečių auginimo pramonė yra viena iš svarbiausių akvakultūros ekonominių komponentų, tačiau pramonė ilgą laiką susidūrė su įvairių patogeninių mikroorganizmų grėsmėmis. Šie patogenai dažnai lemia didelio masto krevečių mirtį, didelę įtaką gamybai ir ekonominei naudai. Įskaitant ūmią hepatopancreatic nekrozės ligą (AHPND), baltojo dėmės sindromo virusą (WSSV), infekcinį poodį ir hematopoetinį nekrozės virusą (IHHNV), krevetės hemocitų iridovirusą (Shiv) ir Enterohepaticus (EHP) ir kt.
Tradiciniai patogeno aptikimo metodai, tokie kaip polimerazės grandininė reakcija (PGR technologija), turi didelį jautrumą ir specifiškumą, tačiau yra sudėtingi, kad galėtų veikti, ilgai užtrukti ir pasikliauti laboratorine įranga. Dėl šių apribojimų PGR technologija netinkama greitam bandymui vietoje. MIRA technologija tapo molekulinio aptikimo įrankiu, tinkančiu naudoti vietoje, nes jos greitos amplifikacijos charakteristikos esant pastoviai temperatūrai ir normali temperatūrai.
MIRA technologijos principas
Kelių enziminis pastovios temperatūros greito branduolio rūgšties amplifikacijos technologija (MIRA technologija) yra nuolatinės temperatūros amplifikacijos technologija, kuri remiasi daugybinių funkcinių baltymų sinergija kambario temperatūroje, kad būtų galima greitai amplifikuoti nukleorūgštis. Tai tikrai nešiojama greito branduolio rūgšties aptikimo technologija vietoje. Palyginti su PGR, MIRA turi daugiau pranašumų.
Mikrofluidinių lustų dizainas ir naujovės
Kelių svarbių krevečių patogeninių mikroorganizmų scheminė RPA aptikimo platformos schema ant lusto
A) Disko tipo mikrofluidinio lusto struktūra. 1: reakcijos kamera; 2: rutulinis vožtuvas; 3: išmetimo prievadas; 4: mėginių ėmimo prievadas;
B) Sprogęs vaizdas. 5: šilumos sandarinimo plėvelė; 6: lusto substratas.
C) Išsamus šešių sektoriaus pradmenų rinkinių išdėstymas. Kiekvienas grunto rinkinys iš anksto pritvirtintas nurodytoje reakcijos kameroje.
D) Išsami eksploatavimo procedūra lusto RPA aptikimo platformoje.
Straipsnyje siūlomas mikrofluidinis lustas, integruotas su „MirA“ technologija, skirta krevečių patogeninių mikroorganizmų multipleksiniam aptikimui. Mikrofluidinės technologijos gali kontroliuoti skysčius mikronų lygio kanaluose, kad būtų galima tiksliai manipuliuoti, ir taip pasiekti efektyvų ir pigių kelių mokesčių aptikimą.
Lustas turi šias pagrindines dizaino funkcijas:
● Išcentrinis mikrofluidinis lustas
Lustas priima išcentrinę pavaros dizainą, naudodama išcentrinę jėgą, kad mėginys tolygiai paskirstytų kiekvieną reakcijos kamerą. Šis dizainas supaprastina veikimo procesą, o operatorius gali užpildyti visą reakciją tiesiog švirkščiant mėginį.
● Kelių taikinių aptikimas
LIP yra iš anksto suskirstytas į bakterijų tipus, kuriuos reikia aptikti: ūmi hepatopancreac nekrozė (V-AHPND), baltojo dėmės sindromo virusas (WSSV), infekcinė subkonaninė nekrozės virusas (IHHNV), shreve hemocyte iridovirusas (Šiv) ir enterohepatitas hepatitas (ehhnv). ) Penkių patogenų pradmenų zondai. Šis dizainas vienu metu gali aptikti šešis genų taikinius vienoje reakcijoje, leidžiančiai greitai patikrinti kelis patogenus.
● realaus laiko fluorescencijos aptikimas
MIRA technologijos amplifikacijos reakcija luste yra sujungta su fluorescenciniu zondu, kuris gali stebėti amplifikacijos reakcijos eigą realiuoju laiku. Zondo dizainas leidžia išleisti fluorescencinį signalą tik tada, kai sukuriamas amplifikacijos produktas, taip pasiekiant greitą ir jautrų kiekybinį aptikimą.
● Mažos koncentracijos reakcijų sistema
Kiekvienam lusto reakcijos vienetui reikia tik 5 μl reakcijos tūrio, o tai labai sumažina reagentų suvartojimą. Kai visa sistema veikia, iki keturių pavyzdžių galima apdoroti vienu metu, ir kiekvienas mėginys gali aptikti penkis patogenus, labai pagerinant aptikimo efektyvumą.
Jautrumas, specifiškumas ir pakartojamumas
Lustų sistemos veikimas apima simetrijos, rezonanso ir pakartojamumo aptikimą.
● Jautrumas
Eksperimentiniai rezultatai rodo, kad lustas gali aptikti tikslinių genų kopijų skaičių net 10 egzempliorių/μl, o jautrumas yra palyginamas ar net aukštesnis nei tradiciniai PGR metodai. Šis didelis jautrumas užtikrina, kad ši technologija gali aptikti ankstyvojo užkrėstus asmenis praktiškai pritaikytus ir taip anksti patikrinti patogenus.
● Specifiškumas
Eksperimente atliko įvairių ne tikslinių patogenų kryžminio reakcijos testus, o rezultatai parodė, kad lustas yra labai būdingas tiksliniams patogenams ir gali tiksliai atskirti įvairių tipų patogenus. Visi ūminės kepenų šokių nekrozės ligos (V-AHPND), baltojo dėmesio sindromo viruso (WSSV), infekcinio poodžio ir hematopoetinės nekrozės viruso (IHHNV), Shrerims Hemacicatidscence viruso (Shiv) ir enterohepatito hepatica (EHP) tyrimai rodo, kad nėra kryžminio rango viruso, o enterohepatito hepatitas (EHP) rodo, kad neliko kryžminio rango. Venkite nespecifinio amplifikacijos.
● Pakartojamumas
Siekdama įvertinti metodo stabilumą, tyrimų komanda atliko kelis pakartotinius eksperimentus. Rezultatai parodė, kad skirtingų eksperimentų variacijos koeficientas (CV vertė) buvo mažesnis nei 10%, tai parodė gerą eksperimentinį pakartojamumą ir nuoseklumą.
Lauko programos ir pranašumai
„MIRA“ technologijos mikrofluidinės lusto dizainas suteikia jam reikšmingų lauko taikymo pranašumų, ypač tinkamų greitam patogenų aptikimui ir stebėjimui krevečių auginime:
● Patogus veikimo procesas
Visam aptikimo procesui reikia tik švirkščiant mėginį į lustą ir paleisti reakcijos įtaisą. Tam reikia beveik ne rankinio darbo ir jis tinka neprofesionalams naudoti vietoje.
● Greito atsakymo galimybė
Sistema gali gauti bandymo rezultatus per 20 minučių, labai sutrumpindama bandymo laiką. Tai labai svarbu greitai reaguojant į ligą ūkiuose ir sumažinant patogenų plitimą.
● Multiplex aptikimo galimybė
Viename bandyme galima nustatyti penkis pagrindinius patogenus, o tai labai pagerina aptikimo efektyvumą ir taupo aptikimo sąnaudas bei laiką.
MIRA technologijų perspektyvos
Nors PGR technologija jau seniai įvertinta kaip auksinis nukleorūgščių amplifikacijos aptikimo standartas, MIRA technologija parodė puikų taikymo potencialą dėl greitos reakcijos esant nuolatinei temperatūrai, paprastam veikimui ir žemo įrangos reikalavimams. Palyginus su PGR kartu su DNR sekos nustatymu, nustatyta, kad izoterminio amplifikacijos lusto aptikimo rezultatai atitinka PGR rezultatus jautrumo ir specifiškumo atžvilgiu, o MIRA technologijos reakcijos laikas žymiai sutrumpėja. Todėl „MirA“ technologijos mikrofluidiniai lustai laikomi technologija, labiau tinkančia lauko reikmėms, ypač tokiose aplinkose, kuriose reikia greito ir didelio masto patogeno aptikti.
Mikrofluidiniai traškučiai, pagrįsti daugiapakopiu izoterminiu greito nukleorūgščių amplifikacijos (MIRA) technologija, suteikia veiksmingą įrankį patogeninių mikroorganizmų aptikimui krevečių auginime. Ši technologija turi didelio jautrumo, gero specifiškumo, lengvo veikimo ir greito aptikimo greičio pranašumų, o akvakultūros ligų prevencijos ir kontrolės taikymo perspektyvos yra plačios. Toliau tobulinant ir optimizuojant technologiją, tikimasi, kad sistema bus pritaikyta nustatant daugiau vandens patogenų, leidžiančių platesnei ligų prevencijai ir stebėjimui.
Tyrimo rezultatai suteikia patikimą ankstyvojo aptikimo metodą akvakultūros pramonei, kuris gali veiksmingai sumažinti ligos protrūkių riziką, pagerinti ūkių gamybos efektyvumą ir produkciją bei padengti techninį pagrindą tvariam akvakultūros pramonės plėtrai.