Reguliuojama Cas12 aktyvumo kontrolė skatina universalų ir greitą vieno -puodo nukleino rūgščių aptikimą
Išleido: Kinijos mokslo ir technologijų universitetas
Žurnalas: Nature Communications
Poveikio koeficientas: 14,7
Naudojant MIRA technologiją, buvo sukurtas universalus fluorescuojančių nukleino rūgščių aptikimo metodas (APŽVALGA), pagrįstas natrio heparinu. Tyrimai parodė, kad natrio heparinas gali reguliuoti Cas12a skilimo aktyvumą, trukdydamas Cas12a-crRNR surišimo procesui. Reguliuojant natrio heparino koncentraciją, SURVEY yra suderinamas tiek su klasikinėmis, tiek su neoptimaliomis PAM sekomis ir yra taikomas keliems Cas12 potipiams. Šis metodas, kurio aptikimo laikas yra tik 15-20 minučių, leidžia aptikti beždžionių raupų pseudovirusą, A gripo virusą ir SARS{12}}CoV-2 jautrumą ir specifiškumą, viršijantį 95 %. Tai yra maža{14}}kaina ir yra naujas medicinos lauko diagnostikos ir aplinkos stebėjimo aptikimo metodas, padedantis išspręsti sudėtingą jautrumo ir specifiškumo pusiausvyrą tradicinėje CRISPR diagnostikoje.
1. Heparino natrio druskos veikimo mechanizmo tyrimas
Fluorescencinis zondas buvo pridėtas prie Cas12a-crRNR sistemos, turinčios 10 nM tikslinės DNR, ir buvo stebimas greitas ir reikšmingas fluorescencinis signalas nepridedant natrio heparino. Kai buvo pridėta 0,2 ug/ml natrio heparino, fluorescencinis signalas buvo panašus į kontrolinės grupės signalą, o tai rodo, kad natrio heparinas labai slopino Cas12a{{7} ug/ml natrio heparino skilimo aktyvumą yra mažiausia slopinanti koncentracija. Natrio heparino koncentracijai padidėjus nuo 0,2 ug/ml iki 0,5 ug/ml, Cas12a cis- skilimo aktyvumas palaipsniui slopinamas, o esant 0,5 ug/ml, trans- skilimo aktyvumas beveik visiškai slopinamas. Natrio heparino veikimo mechanizmo tyrimai parodė, kad neigiamai įkrautos natrio heparino grupės trukdo teisingam crRNR prisijungimui prie Cas12a ir gali turėti įtakos crRNACas12a dvejetainio komplekso susidarymui.
- MIRA-Cas12a vieno-puodo aptikimas
Patvirtinus natrio heparino veikimo mechanizmą, darbe buvo nagrinėjama vieno -puodo aptikimo strategija (MIRA-Cas12a), derinant MIRA amplifikaciją ir Cas12a-tarpininkaujamą fluorescencijos aptikimą viename mėgintuvėlyje.
Nesant natrio heparino, MIRA-Cas12a derinys nesukėlė reikšmingo fluorescencinio signalo tiksliniame geno koncentracijos diapazone nuo 0,1 aM iki 10 fM. Esant 40 µg/mL natrio heparino, buvo pastebėtas reikšmingas fluorescencijos signalas tikslinėje koncentracijos diapazone nuo 1 aM (≈0,6 kopijos/μL, tūris=30 μL) iki 10 fM (≈6 000 kopijų/μL, tūris=30} μl, lyginant su 0 aptikimu 0-10 kartų). sistema be natrio heparino.
Beždžionių raupų viruso šablono koncentracija buvo 10 fM, o Cas12a-crRNR (100 nM) buvo naudojama tiksliniams genams f31 ir b6r aptikti. Amplifikacijos reakcija buvo nutraukta 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 ir 20 minučių, o MIRA amplifikacijos produkto kiekis skirtingu laiku buvo analizuojamas agarozės gelyje. Tada gauti produktai buvo analizuojami agarozės gelyje trimis skirtingais nustatymais: MIRA-natrio heparino be Cas12a, MIRA-Cas12a be heparino natrio druskos ir MIRA-Cas12a su natrio heparinu. Rezultatai parodė, kad nesant natrio heparino, dėl didelio Cas12a cis-skilimo aktyvumo buvo trukdoma nukleorūgščių amplifikacija. Tačiau pridėjus natrio heparino, dėl sumažėjusio Cas12a cis-skilimo aktyvumo, žymiai padidėjo nukleorūgščių amplifikacija.
Straipsnyje parodyta, kad universalų fluorescencinių nukleino rūgščių aptikimo metodą (APŽVALGA), pagrįstą natrio heparinu, galima pasiekti naudojant klasikines PAM ir neoptimalias PAM sekas. Be to, CRISPR-Dx metoduose, be LbCas12a, taip pat plačiai naudojami AsCas12a ir AapCas12b. Sistemoje, naudojančioje MIRA-AsCas12a, fluorescencija buvo stebima tik esant 40 ug/ml natrio heparino, o tai rodo, kad ji gali aptikti 1fM f31 ir b6r genų. Nesant natrio heparino, MIRA-AapCas12b gali aptikti 1 f31 ir b6r geną. 20 ug/ml natrio heparino skyrimas ne tik pagreitino MIRA-AapCas12b aptikimo greitį, bet ir padidino fluorescencijos intensyvumą. Šie radiniai rodo, kad vieno -puodo metodas, sukurtas naudojant natrio heparino dozę, taip pat taikomas kitiems Cas12 potipiams.
