Matomas ir greitas kačių chafamaparvoviruso aptikimas naudojant daugiafermentinį izoterminį greitą amplifikaciją ir šoninio srauto matuoklio testą
Žurnalas:Ląstelių ir infekcijų mikrobiologijos ribos
Poveikio faktorius:4.6
Kačių chafamaparvovirusas(FeChPV)yra naujas parvovirusas, pirmą kartą aptiktas viduriuojančioms katėms 2019 m. Kanadoje. Jo patogeniškumas ir molekulinės savybės lieka neaiškūs, o jo šeimininkas ir genetinė įvairovė yra labai įvairi, todėl reikia tolesnio epidemiologinio tyrimo. Šiuo metu nėra standartizuoto FeChPV aptikimo metodo.
Daugiafermentinis izoterminis greito stiprinimo{0}}šoninio srauto matuoklio (MIRA-LFD) metodasbuvo sėkmingai naudojamas aptikti įvairius virusus, pasižyminčius greitumu, paprastumu ir tikslių instrumentų nereikalingumu. Tyrėjų komanda sukūrė MIRA-LFD metodą, tinkamą FeChPV, kad būtų galima spręsti klinikinio aptikimo problemas. Nepasitikėdami tiksliais instrumentais,MIRA{0}}LFD metodas užbaigė FeChPV aptikimą 37 laipsnių kampu per 20 minučių ir neparodė kryžminio -reaktyvumo su kitais virusais. Aptikimo riba buvo 32,3 kopijos/μL,10 kartų didesnis nei PGR metodas. Be to, MIRA-LFD metodas aptiko 29 FeChPV-teigiamus mėginius tarp 417 viduriuojančių kačių, kurių pozityvumo rodiklis buvo šiek tiek didesnis nei įdėto PGR metodo. Šie rezultatai rodo, kad nustatytas MIRA-LFD metodas FeChPV aptikti yra efektyvus, ekonomiškas, patikimas ir paprastas metodas, prisidedantis prie ankstyvos FeChPV infekcijos prevencijos ir kontrolės.
1.Eksperimentiniai metodai
Klinikiniai mėginiai:Šiame tyrime panaudoti tiesiosios žarnos tepinėlių mėginiai buvo paimti iš 632 kačių (įskaitant 417 viduriuojančių ir 115 sveikų kačių) ir 474 šunų (įskaitant 342 viduriuojančius ir 132 sveikus šunis) veterinarijos klinikose Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang regione tarp Autonomousner2 ir Inomongolia provincijų200 2024 m.
Nukleino rūgščių amplifikacija:Išskirta DNR nukleorūgštis buvo pridėta prie MIRA sistemos. Rekombinazė ir pradmenys sudarė kompleksą; padedami pagalbinių baltymų ir vieną-granulę surišančių baltymų, jie įsiveržė į dvigubos-grandelės DNR šabloną. Pradmenys susijungia su homologinėmis papildomomis sritimis ir sudaro D-kilpos sritį, o rekombinazė išardoma iš komplekso. Polimerazė prisijungė prie pradmenų 3' galo ir inicijavo DNR sintezę, eksponentiškai amplifikuodama tikslinę šablono sritį. Šis procesas vyko greitai ir efektyviai, todėl per 15 minučių pasiekiamas itin greitas tikslinio fragmento sustiprinimas.
Bandymo juostelės spalvos kūrimas:Nukleino rūgšties amplifikacijos produktas buvo atskiestas santykiu 1:10, užteptas ant bandymo juostelės, o rezultatai buvo nuskaityti po 5 minučių.
Visas procesas nuo nukleorūgščių amplifikacijos iki bandymo juostelės spalvos kūrimo truko tik 20 minučių.
Eksperimente buvo naudojami amp{0}}būsimi biologiniai produktai:
Tyrimo metu buvo tikrinami keturi sukurti konkrečių pradmenų{0}}zondo derinių rinkiniai. Rezultatams pateikti buvo naudojamos agarozės gelio elektroforezė ir nukleorūgščių bandymo juostelės. Visi keturi pradmenų-zondo deriniai galėjo aptikti FeChPV virusą. Remiantis agarozės gelio elektroforezės rezultatais, FeChPV-4 derinys parodė ryškiausią tikslinę juostą, todėl šis derinys buvo pasirinktas tolesniam tyrimui.
Remiantis agarozės gelio elektroforezės rezultatais, amplifikacija 5, 10, 15 ir 20 minučių davė tikslinę juostą. Tikslinės juostos intensyvumas buvo didžiausias po 15 minučių amplifikacijos, nustatant 15 minučių kaip optimalų reakcijos laiką šiam tyrimui. Stiprinimas 36 laipsniais, 37 laipsniais, 38 laipsniais, 39 laipsniais ir 40 laipsnių davė tikslinę juostą, o ryškiausia juosta buvo pastebėta ties 39 laipsniais, nustatant 39 laipsnius kaip optimalią reakcijos temperatūrą šiam tyrimui.
(A pav.: 1: stiprinimas 5 min.; 2: stiprinimas 10 min.; 3: stiprinimas 15 min.; 4: stiprinimas 20 min.) (B paveikslas: 1: stiprinimas 36 laipsniai; 2: stiprinimas 37 laipsniai; 3: stiprinimas 38 laipsniai; 4: 9 laipsnių stiprinimas; 4: 0 laipsniai)
2. Aptikimo našumas
Jautrumas:
(A pav.: MIRA rezultatai, pateikti naudojant agarozės gelio elektroforezę)
(B pav. Įdėtos PGR rezultatai, pateikti naudojant agarozės gelio elektroforezę)
(C paveikslas: MIRA rezultatai, pateikti naudojant nukleorūgščių bandymo juosteles)
Mėginiai buvo skiedžiami 10 kartų, pradedant nuo 3,23 × 10⁶ kopijų / μL. Įdėtas PGR su agarozės gelio elektroforeze galėjo stabiliai aptikti 3,23 × 10² kopijų/μL; MIRA su agarozės gelio elektroforeze ir MIRA su nukleorūgščių bandymo juostelėmis galėjo stabiliai aptikti 3,23 × 10¹ kopijų / μL.
MIRA metodas parodė nuoseklų jautrumą naudojant du skirtingus rezultatų pateikimo formatus, o MIRA metodo jautrumas buvo pranašesnis už įdėto PGR.
Specifiškumas:
(1: FeChPV, kačių chafamaparvovirusas; 2: FPV, kačių panleukopenijos virusas; 3: FeAstV, kačių astrovirusas; 4: FBoV, kačių bokavirusas; 5: CachaV, šunų chaparvovirusas; 6: neigiama kontrolė)
Naujai sukurtas MIRA{0}}LFD metodas aptiko tik FeChPV ir neparodė kryžminio-reaktyvumo su kitais etaloniniais virusais, o tai rodo gerą specifiškumą.
3.Tyrimo santrauka
Šis tyrimas sukūrė MIRA-LFD metodą, skirtą FeChPV aptikti nenaudojant didelio-tikslumo instrumentų. Kaip efektyvus, ekonomiškas ir patikimas, labai jautrus ir specifiškas aptikimo metodas, MIRA-LFD metodas labiau tinka klinikiniam aptikimui, teikiant techninę pagalbą ankstyvai FeChPV infekcijos prevencijai ir kontrolei.
4.AMP-ATEITIES BIOTECHNIKA
MIRA multifermentinis izoterminis greitas nukleino rūgščių amplifikavimas yra technologija, kuri iš tiesų leidžia greitai aptikti vietoje-.
MIRA technologija pagrįsta in vivo genų rekombinacijos taisymo mechanizmu, kuris remiasi kelių funkcinių baltymų sinergetiniu poveikiu kambario temperatūroje, kad būtų pasiektas greitas (5-20 min.), jautrus, specifinis ir saugus nukleorūgščių amplifikacija kambario temperatūroje (25–45 laipsniai). Dėl MIRA technologijos izoterminio pobūdžio jai keliami nedideli įrangos reikalavimai ir paprastas valdymas. Naudojant miniatiūrinius nešiojamuosius įrenginius, jis gali būti taikomas atliekant pirminius bandymus įvairiuose pritaikymo scenarijuose, todėl greitas ir tikslus nukleino rūgščių tyrimas gali būti atliekamas tokiose vietose kaip POCT, bandymai namuose, žemės ūkio laukai ir{7}}svetainės teisėsauga. Remdamasi MIRA technologija, „Amp-future Biotech“ sukūrė seriją greito testavimo vietoje produktų, įskaitant greito nukleino rūgščių atpalaidavimo agentus, izoterminius greito nukleino rūgščių amplifikacijos reagentus, koloidines aukso bandymo juosteles ir miniatiūrinę nešiojamąją įrangą, sukurdama bendrą sprendimą greitųjų{11}molinių tyrimų vietoje. Be to, Amp-future MIRA technologija suteikia taikymo pranašumų, kai ji derinama su CRISPR technologija, NGS, SNP, mikrofluidika ir kt.
Be anksčiau pateiktų{0}}svetainės greitojo testavimo produktų serijos, „Amp-future Biotech“ taip pat siūlo:
Tyrimo reagentai:Reagentų žaliavų teikimas ir techninė pagalba pagrindiniams moksliniams tyrimams, taip pat projektinės literatūros nuorodos.
OEM gamyba:Viso proceso metu gali savarankiškai gaminti didelio{0}}grynumo, didelio{1}}aktyvumo galutinius produktus ir pasiekti pramoninės-mastos gamybą.
Projekto vystymas pagal užsakymą:Sekos informacija ir sekų derinimo analizės rezultatai, projekto pradmenų{0}}zondo projektavimas ir sintezė, projekto plazmidžių sintezė ir pavyzdžiai, projekto ataskaitos ir rezultatai ir kt.
Norėdami gauti daugiau informacijos, kviečiame teirautis.