《„Micropterus Salmoides“ nustatymas rabdoviruso aptikimo metodas, pagrįstas CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing, nustatant didelius burnos burnos bass Flavivrus, pagrindu CRISPR/CAS13. Kinijos hidrobiologijos žurnalas, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
„Micropterus Salmoides“, dar žinomas kaip Kalifornijos bosas ar Amerikos juodasis bosas, yra gėlavandenių žuvų, gimtoji Šiaurės Amerikoje. Pastaraisiais metais ji tapo svarbia ūkininkaujama žuvis visame pasaulyje dėl didelės rinkos paklausos: „Micropterus Salmoides“ turi tvirtą mėsą, nedaug kaulų, skanų skonį, turtingą mitybą, ypač daug baltymų ir mažai riebalų, kurie patenkina vartotojų sveiko maisto poreikį. Todėl rinkos kaina yra palyginti aukšta ir ji dažnai naudojama aukščiausios klasės maitinimo rinkoje. Greitas augimas: „Micropterus Salmoides“ greitai auga ir paprastai gali pasiekti prekių specifikacijas 6-8 mėnesiais. Jis tinka veisimui trumpam ciklui ir gali greitai suvokti investicijų grąžą. Stiprus atsparumas ligoms: Palyginti su kitomis auginamomis žuvimis, „Micropterus Salmoides“ turi stiprų prisitaikymą prie aplinkos, mažiau didelio masto ligos protrūkių ir sumažina veisimo riziką. Ekologinis veisimas: Didžiojo boso bosas gali būti sumaišytas su kitomis gėlavandenių žuvų, tokių kaip sidabro ir žolės karpiai, kurie padeda pasiekti tvenkinio ekologinę pusiausvyrą ir maksimaliai išnaudoti išteklius, dar labiau pagerina veisimosi efektyvumą ir kitus veiksnius. Jį laukia valgytojai ir akvakultūros ūkininkai, o jo veisimosi skalė pastaraisiais metais sparčiai augo.
Nors „Micropterus Salmoides“ yra gana atsparūs ligoms, jie vis dar gali kenčia nuo kai kurių ligų blogomis veisimosi sąlygomis. Tarp jų „Micropterus Salmoides“ rabdovirusas (MSRV) yra labai kenksmingas: pirmą kartą jis buvo rastas Floridoje, JAV 1991 m. Virusas iš pradžių buvo aptiktas laukinių didžiųjų bosų populiacijose, o po to palaipsniui išplito į daugelį gėlavandenių ežerų ir rezervuarų JAV, tapdamas vienu iš pagrindinių Largemouth boso ežerų.
Klinikiniai sergančių žuvų simptomai
A: Sveikas didžiausias bosas, rodyklė rodo trynio maišelį; B: Susirgęs didžiulis bosas, rodyklė nurodo trynio maišelį.
Perdavimo šaltinis dažnai užkrėsta kepti arba suaugusiomis žuvimis, užterštais vandens telkiniais ir virusu nešiojančiomis laukinėmis žuvimis; Šis virusas gali būti perduodamas tiesiogiai kontaktuojant, išmatų išsiskyrimu ir vandens telkiniais, ir labiau linkęs atsirasti esant prastai vandens kokybei ar didelio tankio veisimo sąlygoms. difuzija. Virusas gali sukelti letargiją, klajojančią, pilvo patinimą ir kūno iškraipymą nepilnamečių žuvims, taip pat sukelti nekrozinę opas ir kraujuoti daugiatvarkius. Užkrėstas mirtingumas viršija 90%.
Klinikiniai dirbtinai užkrėstų mikropterus salmoidų simptomai
A: Sveikas didžiausias bosas; B, C, D: dirbtinai užkrėstas dideles bosas.
Kiekvienais metais dėl MSRV prarandama daugiau nei 30% „Micropterus Salmoides Fry“. Šiuo metu viruso gydymo ir aptikimo metodai vis dar nesubrendę, ir nėra jokio konkretaus vaisto, skirto jį gydyti. Todėl labai reikia aptikti virusą laiku prieš infekciją ir imtis veiksmingų prevencinių priemonių, kurios gali tam tikru mastu sumažinti veisimosi proceso nuostolius;
Be to, sunku atlikti aptikimą vietoje be sudėtingos aptikimo įrangos su esama aptikimo technologija. Išspręsdamas šį iššūkį, Pietų Kinijos žemės ūkio universiteto tyrimų komanda sukūrė naują aptikimo metodą, derinantį MIRA su CRISPR sistema. Šis metodas turi stiprų specifiškumą, didelį jautrumą ir paprastą veikimą, o tai labai pagerina MSRV aptikimo efektyvumą, taip pat padeda kuo anksčiau nustatyti MSRV ir imtis prevencijos bei kontrolės priemonių.
„Mira“ grunto derinio atranka
Genų fragmentui, kuriame yra tikslinė seka, amplifikuoti buvo naudojamos dvi poros skirtingų MIRA pradmenų, o amplifikuoti produktai buvo veikiami agarozės gelio elektroforezės. Elektroforezės grafikas buvo 100 bp padėtyje, o ryškios juostos pasirodė visose trijose juostose, tai rodo, kad yra nespecifinių amplifikacijos produktų. Amplifikuotos tikslinės juostos, esančios 250 bp 2 ir 3 juostose, buvo atitinkamai kiekybiškai analizuojamos naudojant J programinę įrangą, o kiekybinės analizės rezultatai buvo išreikšti „pilka verte“. Remiantis analizės rezultatais, galima daryti išvadą, kad kuo mažesnė pilka vertė, tuo didesnis pradmenų naudojimo greitis, tai yra, tuo didesnis pradmenų specifinis surišimo amplifikacijos efektyvumas.
Rezultatai parodė, kad specifinis surišimo amplifikacijos efektyvumas buvo didelis, kai buvo naudojama MIRA-F2/R2 pradmenų pora.
„Mira“ pradmenų porų atrankos elektroforezės gelio vaizdo ir pilkos vertės analizė
a. Elektroforezės juosta M: 2000 bp DNR žymeklis; Elektroforezės juosta 1. Neigiamas DNR mėginio amplifikacija; Elektroforezės 2 juosta. MIRA-F1/R1 pradmenų pora sustiprina tikslinį fragmentą (224 bp, kaip parodyta dėžutėje); elektroforezės juosta 3. Mira-F2/R2 pradmenų pora sustiprina taikinio fragmentą (255 bp, kaip parodyta dėžutėje); b. Juostos pilkosios vertės analizė (kaip parodyta dėžutėje)
CRISPR/CAS13A aptikimo sistema
Baigus CRISPR/CAS13A aptikimo sistemos reakciją, ji yra apšvitinta ultravioletine šviesa, kad būtų galima stebėti rezultatus.
CRISPR/CAS13A aptikimo sistemos-fluorescencinės ryškumo diagrama
1-3. Pridėta visa sistema su RNR standartu; 4. CrRNR pridėta; 5. Pridedama Cas13A baltymo; 6. Nėra SSRNA reporterio zondo; 7. Neigiama kontrolė
CRISPR/CAS13A-MSRV Optimali reakcijos sistema
Mes atlikome eksperimentus, naudodami RNR standartus ir amplifikuotą mėginio RNR. Tikslinės RNR padėties nustatymo greitis buvo geresnis su crRNR2 nei su CRRNA1. CRRNR1 turėjo stipresnį galutinį fluorescencijos signalą nei CRRNA2. Mišrus crRNR 1+ crRNR2 naudojimas vienodomis proporcijomis galėtų sujungti abiejų pranašumus ir pasiekti geresnį reakcijos efektyvumą.
CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo reakcijos sąlygų ir aptikimo rezultatų optimizavimas ir aptikimo rezultatai
a. Standartinių RNR aptikimo rezultatų, naudojant CRRNR su skirtingomis tarpiklių sekomis, aptikimo rezultatų palyginimas;
b. Lyginami standartinių RNR fluorescencinio signalo duomenų, aptiktų aptikimo sistema skirtingose temperatūrose, fluorescencinio signalo duomenų palyginimas;
c. Standartinio RNR fluorescencinio signalo duomenų palyginimas naudojant RNR reporterio zondus su skirtingomis koncentracijomis;
d. Standartinių RNR aptikimo rezultatų, aptiktų naudojant Cas13A/CRRNR zondo kompleksus su skirtingais koncentracijos santykiais, aptikimo rezultatų palyginimas;
Norint ištirti reakcijos temperatūros poveikį aptikimo sistemai, buvo nustatyta skirtinga 31 laipsnio, 34 laipsnių, 37 laipsnių ir 41 laipsnio reakcijos temperatūra. Optimali CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistemos reakcijos temperatūra buvo 37 laipsnių.
Norint ištirti SSRNR reporterio zondo koncentracijos poveikį aptikimo sistemai, bandymo diapazone fluorescencijos intensyvumas buvo teigiamai koreliuojamas su SSRNR reporterio zondo koncentracija. SSRNA reporterio zondo koncentracijos aptikimo poveikis nebuvo labai skirtingas, kai 500-700 nmol/l. Atsižvelgiant į faktines ekonomines problemas, optimali SSRNR reporterio zondo koncentracija buvo 500 nmol/l.
Norėdami ištirti skirtingų CAS13A ir CRRNR reakcijos koncentracijos santykio poveikį aptikimo sistemai, kai CAS13A: crRNR santykis buvo 4: 1 ir 3: 1, remiantis 100 nmol/L dalimi santykiu, Cas13a pasiekė soties; Kai CAS13A kiekis buvo pastovus, fluorescencijos signalo intensyvumas nebuvo teigiamai koreliuojamas su CRRNR kiekio padidėjimu. Todėl, kai CAS13A ir CRRNR santykis yra 2: 1, CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistema gali pasiekti maksimalų aptikimo aktyvumą.
Jautrumo vertinimas
Norint ištirti minimalią MSRV aptikimo koncentraciją naudojant CRISPR/Cas13A-MSRV aptikimo sistemą, RNR standartas buvo praskiestas 10 kartų serijoje ir aptiktas CRISPR/Cas13A-MSRV aptikimo sistemos. CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistema gali aptikti mažiausiai 100FM MSRV taikinio RNR. Kai tikslinė RNR koncentracija yra mažesnė nei 100FM, mašinos aptinkamas fluorescencijos signalas reikšmingai nesiskiria nuo tuščio valdymo. Todėl CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistema gali aptikti mažiausiai 100FM MSRV SSRNR.
CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistemos specifiškumo įvertinimas MSRV
Mėginio bandymas
Sergančių žuvų mėginiams, turintiems akivaizdžių ligos požymių, surinktų iš jūros boso ūkių, mes patikrinome, ar sergančių žuvų užkrėstas patogenas buvo MSRV. Mes panaudojome pradmenis, būdingus MSRV kapsido baltymų sekai PGR amplifikacijai, ir išsiuntėme atitinkamas juostas elektroforezės diagramoje bandymui. Po palyginimo patvirtinome, kad tai yra MSRV.
MSRV sekos informacijos patvirtinimas
a. PGR amplifikacija 228 bp produkto juosta iš MSRV pradmenų; b. MSRV kapsido baltymų seka, palyginti su NCBI, paryškintos sekos yra priešais ir pasroviui surišimo vietose, o šešėlinės vietos yra tikslinės vietos CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNR1 surišimui
Sergantys žuvų mėginiai, užkrėsti MSRV, buvo iš anksto apdoroti ir iš anksto iš anksto sustiprinami viruso RNR, o po to buvo tiriami naudojant neigiamą kontrolinę grupę. Tuo pačiu metu mėginių cDNR buvo ekstrahuota palyginimui su įprastu qPCR. Teigiami mėginiai (Nr. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 ir 15), aptikti CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistema, buvo tokie patys kaip įprasto qPCR rezultatai, kur qPCR CQ vertė buvo nuo 18 iki 25; tuo tarpu neigiamų mėginių slenksčio ciklo skaičius (Nr. 1, 2, 4, 5, 9, 10 ir 11) buvo didesnis nei 38, tai rodo, kad mėginiuose nebuvo MSVR viruso. Apibendrinant galima pasakyti, kad CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistemos ir įprastos RT-QPCR aptikimo duomenys buvo nuoseklūs, tai rodo, kad CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo sistema yra įmanoma ir tam tikru mastu gali pakeisti pradinius įprastus ir sudėtingus aptikimo metodus.
Vertikalios palyginimo diagrama iš qPCR aptikimo duomenų su qPCR ir CRISPR
a. qPCR MSRV klinikinio mėginio slenksčio ciklo skaičiaus diagramos nustatymas; Aptiktas mėginio ciklo skaičius buvo lyginamas su neigiamo etaloninio ciklo skaičiumi, naudojant t-testų analizę (** P<0.01);
b. CAS13A kartu su MIRA nustatyta MSRV klinikinio mėginio fluorescencijos diagrama; Aptikta mėginio fluorescencijos vertė buvo palyginta su neigiama etalonine fluorescencijos verte, naudojant t-testų analizę (** P<0.01)
Apibendrinant galima pasakyti, kad šiame tyrime nustatytas CRISPR/CAS13A-MSRV aptikimo metodas nereikalauja brangių eksperimentinių priemonių, todėl nustatymas vietoje yra greitas, tikslus ir patogus. Taigi, jei šis aptikimo metodas naudojamas laiku atrasti MSRV faktiniame veisimo procese ir imtis tikslinių bei veiksmingų priemonių, jis gali žymiai sumažinti nuostolius, kuriuos sukelia ligos veisimosi procese. Be to, šis aptikimo metodas yra greitas, labai jautrus ir specifinis, ir turi puikias pritaikymo ir paaukštinimo perspektyvas.